FİKSASYON | 2. adım | Daimi Preparat Hazırlama | Mikroteknik

 Daimi Preprat hazırlama yolunda 2. adımımıza Hoş geldiniz!

İlk önce incelemek istediğimiz canlıyı uyuşturmuştuk. Şimdi ise öldürmemiz gerekiyor. Fakat asıl dikkat etmemiz gereken nokta şu: Amacımız canlıya işkence uygulamak değil. Canlı aniden ve en kısa zamanda ölmeli ve sonrasında dokusunun, hücrelerinin, proteinlerinin yapısı bozulmamalı. Çünkü biz uzun zaman sonra bile bu dokuları incelemek istiyoruz. 3 boyutlu yapısı bir proteini, şişmiş hatta patlamış bir hücreyi mikroskopta nasıl inceleyebiliriz ki?

Bu nedenle fiksasyon aşaması çok önemlidir. Fiksasyon (başka bir deyişle tespit etmek) için kullanılan tüm malzemelere, çözeltilere fiksatif veya fiksatör denmektedir. Fiksatifler dokuya etki ettikleri zaman sitoplazmayı pıhtılaştırır veya çökeltir. Fakat endişelenmeyin, her iki durumda da proteinler esas yapısını korur. 

Fiksasyon işleminin, anatomik elemanların yapı ve şekillerini değiştirmeye vakit bulmadan süratle öldürmek, hücre ve dokunun morfolojisini korumak ve bunların çeşitli boyalarla boyanmasına hazırlamak için yapılan bir çalışma olduğundan az önce bahsettik. (Aklınızda yer etsin diye bir kez daha tekrar ettim:))

Fiksasyonun yapılmasıyla:

• Doku ve hücreler arasındaki kırılma indisi arttırılmış olur. 
• Hücre ve dokular sertleşir ve bundan sonraki işlemler kolaylaşır. 
• Hücre ve doku elemanlarının dağılması önlenmiş olur.

➕Yani farklı bir bakış açısıyla fiksasyon için şunu söyleyebilirim: Canlıyı öldürmek fakat sanki canlıymış hissi vermek. 👍

İYİ BİR FİKSATİF NASIL ÖZELLİKLER TAŞIMALI?

• Dokuya iyi bir şekilde nüfus etmesi gerek. Bu yetenek çeşitli fiksatiflere göre farklılık gösterir. Mesela asetik asit dokuya hızlıca nüfus eden bir fiksatörken, ozmik asit veya pikrik asit dokuya çok yavaş bir şekilde nüfus eder. 
• Dokudaki proteinlerin tümünü pıhtılaştırmalı. Bu pıhtılaştırma ani şiddetli olmalıdır. Aksi takdirde dokuda büzüşmeler meydana gelir. Asetik asitli fiksatifler iyi sonuç verir. (Biliyorum asetik asidi çok övdüm ama ne yapayım gerçekten iyi bir fiksatif. En hamaratı olanlarından birisi...) 
• Fiksatörün asitliği de önemlidir. Dokuların asitleştirilmesi ile pıhtılaşma ve çökme olur. 
• Tespit esnasında (tespit etmek=fiksasyon) sırasında sıcaklık da önemlidir. Genellikle histolojik (histoloji= dokuyu inceleyen bir bilim dalıdır.) fiksatifler oda sıcaklığında kullanılmalıdır. 
• Ayrıca küçük bir detay daha: Fiksatifin hacmi materyalin 15 ile 20 katı kadar olmalı. (yoksa dibe çöküp yapışabilir. 

Gördüğünüz üzere hamarat fiksatife ulaşmak için pek çok özelliğe ihtiyaç vardır. Yani yalnız kullanılan bir kimyasal madde iyi bir fiksatifin bütün üstünlüklerine sahip değildir. Tek başına kullanılan fiksatifler sınırlıdır. Daha çok birbirleriyle karıştırılarak kullanılan fiksatiflerin birinin zararlı etkisini diğeri bertaraf eder. 

𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲡𛲢𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣

Tek başına en çok kullanılan fiksaitfler:

1. formalin
2. aseten
3. etil alkol

𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣

En çok kullanılan fiksatifler:

1. formaldehit
2. etil alkol
3. asetik asit
4. pikrik asit
5. potasyum bikarbonat
6. vb...

𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣𛲣

Uygun fiksatif seçimi yapılması istenen analize göre değişir. Mesela suda hazırlanmış bir fiksatif dokudaki glikojeni, alkolde hazırlanmış bir fiksatif lipitleri (yağları) eriteceği için söz konusu maddelerin araştırılmasında kullanılamazlar. 

KüÇüK BiR NoT: Nukleus ya da kromozomlar incelenecekse asit fiksatifler çok kullanılır. Aseton, formalin ve glutaraldehit en az denaturasyona neden olduklarından ve enzimleri de iyi koruduklarından enzim etkinliğini araştırmada kullanılır.

Çok fazla kimyasal maddeyi fiksatör olarak kullanabildiğimi için bunların sınıflandırılmasına ihtiyacınız olacağını düşündüm. 

YAPILARINA GÖRE FİKSATİFLER:

Fiziksel Fiksatifler ve Kimyasal Fiksatifler olarak ayırabiliriz. 

Fiziksel Fiksatifler: 

Bu fiksatifler hücre veya dokuyu ya düşük sıcaklık ya da yüksek sıcaklıkta uygulanır. 

Düşük sıcaklıkta kullanılan fiksatör organizmayı durdurur. Bu suretle doku ve hücredeki proteinler çöker ve pıhtılaşmaya uğrar. 

Yüksek sıcaklıkta ise materyal su veya alkolde kaynatılır. Fiziksel fiksatiflere desikasyon (kurutma) da dahil edilebilir. Desikasyon işlemi daha çok frotis işleminde (yayma işleminde) yaygın olarak kullanılır. 

Şimdi Kimyasal Fiksatiflere bakalım! (öncelikle şunu demem gerekiyor. hormonlara ilgili yazdığım bir yazımda size çok önemli bir husustan bahsetmiştim. biyolojide HER ŞEY MUTLAKA EN AZ İKİYE AYRILIR!) Kimyasal Fiksatifleri 2'YE AYIRMAK MÜMKÜNDÜR.

1. Madensel Fiksatifler
2. Organik Fiksatifler

1.MADENSEL FİKSATİFLER

------------------------------------------

Madensel Fiksatifler 2'ye ayrılır.

1. Madensel tuzlar (bikarbonatlar): Genellikle stronsiyum ve Çinko bikarbonatları kullanılır. Bazik özelliktedirler. Baryum, Kalsiyum ve Bakır bikarbonatları mitoz bölünme için iyi bir tespit maddesidir (fiksatördür). Bu çözeltilerin pH'ı 4,2 'nin üzerinde olursa sitoplazma iyi tespit edilir. pH'ı 4,2'nin altında olursa çekirdek daha iyi tespit edilir. Biraz daha madensel tuzlara örnek isterseniz: civa klorür, platin klorür, uranyum nitrat, sodyum florür vb... tespit özelliği olan diğer madensel tuzlardır.
2. Madensel asitler: Temel olarak 2 TANE en çok bilinen örnek vereceğim : 

• Kromik asit: kırmızı kristalleri vardır. dokuyu oldukça iyi sertleştirse de dokuda büzülmeye yol açar. saf suda %1'lik çözeltiler halinde kullanılır. dokuda büzülmeye sebep olduğu için dokuyu büzüştürmeyecek başka fiksatörerle de kullanılabilir. 
• Ozmik asit: sarımsı kristaller halindedir. çabuk buharlaşan bir maddedir. ancak buharı zehirleyici özelliktedir. hücreleri çok hızlı bir şekilde öldürür. Sitoplazmayı iyi tespit eder. çekirdeği tespit etme özelliği yoktur. 

ORGANİK FİKSATİFLER

-----------------------------------

2'YE AYRILIR: organik asitler ve organik indirgeyiciler

• Organik asitler: Neden 2'ye ayırmıyoruz ki? en çok kullanılan 2 organik asit nelerdir? asetik asit ve pikrik asittir. 

Asetik asit: hücre içine çok kıs bir zamanda girer ve çekirdeği (nukleusu) iyi tespit eder. renksizdir. %1'lik çözeltileri kullanılır. 17 C'nin altında katıdır. Katı haline Glasiyal Asetik Asit adını alır. Tek başına kullanıldığında sitoplazmayı iyi tespit etmez. Dokuda şişmeye neden olur. Bu nedenle dokudaki şişmenin önüne geçen ve uygun ortamda dokudaki fazla suyu alma özelliğine sahip olan alkolle birlikte kullanılır. Fakat her zaman alkolle birlikte kullanılmasına gerek yoktur. Dokuları büzüştüren bir fiksatifle de büzülme sorununu çözmek için kullanılabilir. 

Pikrik asit: Sarı renkli kristal halindedir. Hücre içine geçişi yavaştır. Dokunun çok fazla büzülmesine neden olur. Bu nedenle tek başıına ender kullanılır. Asetik asitle bu sorun ortadan kalkabilir. Lipitleri (yağları)  eritmez, karbonhidratları tespit etmez ve glikojn için de iyi bir glikojendir.

• Organik indirgeyici: Metil alkol ve Etil alkol olmak üzere en çok kullanılan indirgeyici olarak 2'YE ayırabiliriz. 

Metil alkol: Frotisler için (yayma işlemi ile hazırlanılan preparatlar için)  iyi bir fiksatiftir. Buharı göz için zararlıdır.
Etil alkol: Saf haldeyken iyi bir fiksatiftir. Dokuların fazla suyunu almak için kullanılır. Frotisler için yaygın kullanılır. Yağları çözer ve glikojeni çöktürür. Aynı zamanda sitoplazmayı çok iyi tespit eder. 

👉KüÇüK NoTLaR:

→ Fiksatiften hemen sonnra materyalin yıkanma işlemi gerçekleşir. İyi yıkanmayan materyal (sonraki aşamalarda) iyi kesilmez ve iyi boyanmaz yıkama işleminde Saf su tercih edilir. Yıkanacak olan materyal suyun rengini değiştirir. Bazı fiksatiflerden snraki yıkama işlemi alkolle yapılır. Bovin fiksatifi... gibi.